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肽分析反相色譜柱在分离中有什么作用
点击次数:73 发布时间:2019-05-28
     肽分析反相色譜柱能够拓宽从蛋白质组学应用到肽图分析应用的pH范围,同时提供出色的温度稳定性。肽分析反相色譜柱填料表面带少量正电荷,可与含TFA的标准洗脱液或弱酸性改性剂(如甲酸)一起使用,分析人员无需在可获得清晰峰形的反相洗脱液与能够避免MS信号减弱的洗脱液之间折衷。
    通过氯硅烷把疏水相键合到硅胶基质上就形成了反相HPLC吸附剂,这些硅胶基质分子上有一个能附着疏水基团的活性氯基。形成疏水相的烃基通常是十八碳(C18)、八碳(C8)或四碳(C4)的线性脂肪族烃。烃链的长度在蛋白质分离效果上一般没有什么不同。对于肽和少于5000道尔顿的小分子蛋白质选用C18色譜柱。小的分子和亲水的肽通常在小孔的C18柱子上分离得较好。大于5000道尔顿的蛋白质或小分子多肽非常疏水,选用C4色譜柱。C8柱与C18色譜柱的应用差不多,但分离个别肽时有时表现出不同的选择性和分离能力。苯基柱没有C4柱子那么疏水,所以对有些多肽表现出独特的选择性。反相表面的细微差别有时会造成RP-HPLC对多肽选择性的不同,可以利用这一点来优化特定肽的分离。
    不同的反相吸附剂在分离蛋白质酶消化物中的肽碎片时可能表现出不同的选择性。用两种RP-HPLC色譜柱分离β-乳球蛋白A的胰蛋白酶消化物碎片,结果表明不同的相有时对肽的反相分离具有微小的影响。与通常使用的C18色譜柱相比,C4柱的保留时间稍短,肽碎片洗脱图形也有某些程度上的不同。测试不同的色譜柱是确定哪个柱子分离度的实用方法。有些实验室利用肽分析反相色譜柱的選擇性差異來進行肽的二維分離。
 
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